style="width:1.98004in;height:0.58652in" /> (1) 本文是学习GB-T 35024-2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法。
本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏、动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反刍动物成分，和13
种常见肉品或掺杂成分(骆驼、马、驴、牦牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠)动物物种成分的定
性检测。方法的最低检出限为(质量百分比):水牛5%,哺乳、反刍、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为1%,骆驼、
牦牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1%。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
SN/T 3561 国境口岸卫生监督食品采样、送样规程
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
液相芯片技术 suspended bead array
通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种
目标成分进行同时检测。
3.1.2
液相芯片探针 suspended array probe
固定于微球表面，能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子。
3.1.3
质控探针 quality control probe
用来监控芯片反应是否正常的探针。
注：本标准使用的是人工合成的一段寡核苷酸探针(polyT²opolyA₂o,5'端氨基标记)。
3.1.4
荧光强度中位值 median fluoresence intensity
液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背景值
校正后得到的数值。
GB/T 35024—2018
3.1.5
阈值 cutoff value
判定阳性信号的最低荧光强度中位值。通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时
保证灵敏度需求。
下列缩略语适用于本文件。
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)
dATP: 脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)
dCTP: 脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)
dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)
dTTP: 脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)
EDC:1- 乙基- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐[N-
(3-dimethylaminodipropyl)-N'-ethylcar-
bodiimade]
EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)
MES:2- 吗啉乙磺酸[2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid]
SA-PE: 链霉亲和素-藻红素(streptavidin- phycoerythrobilin)
SDS: 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)
Taq: 水生栖热菌(Thermus aquaticu)
TE: 由 Tris 和 EDTA 配制而成的缓冲溶液(Tris-EDTA buffer solution)
TMAC: 四甲基氯化铵(tetramethyl ammonium chloride)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
对样品中的靶基因进行 PCR 扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR
扩增产物结合，采用流
式细胞技术对目标成分进行检测。每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针，特异结合一种目标
核酸序列。该核酸序列连接荧光标记物。单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，
一束
激光检测微球的色标编码，另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物。检测单一成分时，将该成分
PCR 产物与相应微球进行反应；检测多种成分时，可以将各个成分的 PCR
产物与微球混合物进行反
应。检测实验室需达到 GB/T 27403—2008 的要求。
质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针，反刍动物通用引物探针，以及13种特异性引物和探针
序列参见附录 A 中表 A.1。
6.3 dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。
GB/T 35024—2018
6.11 分子量标准品(最小片段≥20 bp,最大片段≤2000 bp)。
6.12 TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1 mmol/L EDTA)。
6.13 电泳缓冲液(10×TBE:Tris 54g,硼酸27.5 g,20 mL0.5 mol/L EDTA
·Tris-HCl,pH 8.0,加水 至1000 mL;50×TAE:Tris 242 g,100 mL0.5 mol/L
EDTA,pH8.0,冰乙酸，57.1 mL, 加水至1 L)。
6.14 加样缓冲液(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液)。
6.15 非磁性微球(微球直径5.6 μm, 羧基修饰，按比例掺入660 nm 和730 nm
两种分类荧光染色，每
种荧光有10种浓度，根据比例不同可以把球型基质分类为100种)。
6.16 0.1 mol/L MES溶液。
6.17 EDC 溶液(10 mg/mL)。
6.18 0.02% Tween-20。
6.21 TMAC 溶液(5 mol/L TMAC,20% N-月桂酰肌氨酸，1 mol/L Tris-HCl,pH
8.0,0.5 mol/L EDTA,pH 8.0)。
6.22 CTAB 提取液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02
mol/L Na₂EDTA,pH 8.0)。
6.23 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682
中二级水的要求。
7.5 微量移液器：0.5μL～10μL,10μL～100μL,20μL～200μL,200μL～1000μL。
采样、送样要求应符合GB/T14699.1 和SN/T3561
的规定。按照8.1～8.2进行前处理，处理后的
样品分成三等份，包括检样、复检样和贮存样。
先依次用70%乙醇和ddH2O
冲洗2次～3次，洗去外源成分和调料等，控干水分，搅碎，收集到干
净50 mL 离心管或干净密封袋中，冻存于-20℃。
混匀后直接分装到干净50 mL
离心管或干净密封袋中，根据样品种类贮存于-20℃或4℃。
GB/T 35024—2018
称取1g～2g 处理好的样品于50 mL 离心管中，加入2mL～5mLCTAB
提取液，加入20μL~ 100μL 的 2 0 mg/mL 蛋白酶 K,65℃ 温育1 h,
期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必 要时再加入适量 CTAB
提取缓冲液。室温12000 g 离心10 min, 转移上清至2 mL 离心管中，加入等
体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1)颠倒混匀，室温12000 g
转速下离心10 min 。转移上清
液至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1),颠倒混匀，室温下12000
g 离心
10 min;转移上清至干净离心管中；加入等体积的 CTAB 沉淀液混匀，室温沉淀1 h
。加入0.8倍体积 的异丙醇或2倍体积-20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，
一20℃放置30 min～1h,12000g 4℃离心 10min,
弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 g 4℃ 离心10 min,
弃上清，室温下晾干。加入 50μL～100μL 灭菌双蒸水，室温10 min, 混匀，
-20℃保存。也可用等效 DNA 提取试剂盒提取模 板 DNA。
取10 μLDNA 溶液加蒸馏水稀释至1 mL,
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测
260 nm和280 nm 处的吸光值。 DNA 的浓度按照式(1)计算，当OD2/OD₂
比值在1.7～2.1之间时，
适宜于 PCR 扩增。扩增前将所有样品DNA 调至约5 ng/μL～50 ng/μL。
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式中：
c——DNA 浓度，单位为纳克每微升(ng/μL);
A— 260 nm 处的吸光值；
N——核酸稀释倍数。
反应体系总体积为25μL, 其中包含：10×PCR 缓冲液2.5μL,2.5 mmol/L dNTP
2μL,单一待检 目标动物成分的上、下游引物(根据检测目标物种确定)各0.5μL
(引物浓度10 μmol/L),5 U/μL Taq
DNA 聚合酶0.2μL,5μLDNA 模板(5 ng/μL～50
ng/μL),用灭菌双蒸水补足体积至25μL。
95℃预变性10 min;95℃ 30s,60℃30s,72℃30s,30
个循环(其中哺乳动物40个循环);72℃
延伸5 min;4 ℃保存。
取出微球存储管以最高转速涡旋30 s, 超声处理15 s 。选一种微球50 μL～1.5
mL 离心管中，
10000g 离心2 min, 弃上清，用50μL0. 1mol/L
MES(pH4.5)重悬微球，彻底涡旋使微球分散成均匀
的悬浊液状态，加入一种0.5μL 预先稀释好的(0.05 nmol) 探针。制备新鲜的
EDC 溶液(10 mg/mL),
取2.5μLEDC 至微球中，彻底混匀，室温避光摇动30 min,
重复此步骤一次。加入1mL0. 1% SDS,低
速涡旋混匀，12000 g 离 心 2 min, 小心移除上清，再加入1 mL0.02%
Tween-20,低速涡旋重悬，
GB/T 35024—2018
12000g 离 心 2 min, 小心移除上清，最后用75μLTE
缓冲液重悬微球，4℃避光保存。
9.4.2.1 单微球探针
取样品的PCR 产物5μL 于45μL
的无菌水中，涡旋混匀。将单一成分微球探针涡旋重悬，与PCR
产物反应。反应体系为：微球0.5μL,PCR 产 物 1 μL,1.5×TMAC 33μL,用 1 ×TE
15.5 μL 调至
50μL, 热反应条件为：95℃ 5 min,60℃ 10 min,4 ℃保存。
9.4.2.2 多微球探针
取样品的PCR 产物5μL 于45μL
的无菌水中，涡旋混匀。将每一种微球探针均涡旋重悬，与PCR
产物反应。反应体系为：每一种微球探针0.5μL, 每一种PCR
产物1μL,1.5×TMAC33μL, 用1×TE
15.5μL 调至50μL。 热反应条件为：95℃ 5 min,60℃ 10 min,4℃保存。
将杂交产物转到无菌抽滤板中，抽干，同时记录杂交体系对应孔位置。将 SA-PE
用 1 ×TE 稀释到 4 ng/μL,每孔加入50μL, 避光震荡2 min, 再室温震荡5 min。
抽干滤孔板，用125 μL TE 洗三次，用
125μL TE重悬。用矫正液矫正液相芯片仪，将上述处理好的样品上机检测。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、质控对照、空白对照。分别以目标引物探针对应的动物物
种的肌肉或 DNA 溶液作为阳性对照，以提取的植物组织(大豆等任一植物)或 DNA
溶液作为阴性对
照，用质控探针作检测体系的质控对照，用无菌双蒸水作空白对照。对照样品按照9.1步骤提取
DNA, 也可使用购买的DNA
溶液作为阳性或阴性对照。所有样品设3个重复，以荧光强度中位值的平均值
作为样品读数。
11.1.1 质控探针荧光强度中位值大于或等于空白对照20倍。
11.1.2 阳性对照荧光强度中位值大于阈值(各成分阈值设定参见附录 A
中表 A.2)。
11.1.3 阴性对照荧光强度中位值低于阈值。
11.1.4
在满足上述结果条件下，如果样品荧光强度中位值大于或等于阈值，判定为阳性；如果低于阈
值，判定为阴性。
11.2.1 样品检测结果阳性，表述为该样品中含有某某成分。
11.2.2 样品检测结果阴性，表述为该样品中某某成分含量低于检测线。
按照GB/T 27403—2008 中附录 D 的规定执行。
GB/T 35024—2018
(资料性附录)
常见畜禽动物成分液相芯片扩增引物探针序列及检测阈值
表 A.1
注明了本标准所使用的哺乳动物、反刍动物、骆驼、马、驴、牦牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、
鸭、大鼠、小鼠成分检测的引物探针序列，以及靶基因名称。表 A.2
规定了各靶标的检测信号阈值。
表 A.1 引物和探针序列
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GB/T 35024—2018
表 A.1 (续)
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表 A.2 探针检测阈值
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